大多数分子的基因表达与蛋白质丰度密切相关，但蛋白质功能和最终的生物学结果还受翻译后修饰所调节的。尽管单细胞测序技术（scRNA-seq）已经可以深度到单细胞水平，然而蛋白质组学和磷酸蛋白质组学仍达不到。空间细胞分选策略在一定程度上可以克服这些限制，同时保留了组织的空间分辨率。
近期，德国海德堡德国癌症研究中心血管肿瘤和转移分部的研究者在Cell旗下的《Developmental Cell》（IF：10.1，中科院JCR 1区）上发表题为“A spatial vascular transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic atlas unveils an angiocrine Tie–Wnt signaling axis in the liver”的研究成果。该研究巧妙地利用空间细胞分选策略，完成了对肝小叶内皮细胞的空间转录组、空间蛋白组和空间蛋白磷酸组学分析，为该方向的研究提供了有效的、具有广泛适用性的实验设计。同时，作者也发现了一条重要的Tie-Wnt信号轴，对促进肝再生具有关键作用。
肝脏内皮细胞的空间多组学实验设计和总体结果的展示
作者通过分析已发表的肝内皮细胞（L-EC）scRNA-seq中的表面分子表达情况，并通过流式细胞术分析获得了不同L-EC亚群，且保持L-ECs空间坐标的能力，分别为门静脉结节 [PN]、门静脉周围[PP]、中央周围 [PC]和中央静脉 [CV]。
作者在每个分群中共准备了4个生物学重复（每个生物学重复来自于30个小鼠肝内皮细胞），并将这些样本进行了mRNA-seq、label-free蛋白质以及Label-free磷酸化蛋白质检测。总体分析结果展示如下：
1. 转录组、蛋白组及磷酸蛋白组分别检测到28727个基因、5015个蛋白和3447个蛋白上的19607个蛋白磷酸化位点（下图G）。
2. 磷酸化几乎都发生在丝氨酸（S）、苏氨酸 (T)和酪氨酸 (Y)残基上，占比分别为76.7%、20%和3.3%（下图G）。通过比较四个群体的差异表达，定义了所有肝内皮细胞转录物、数千个蛋白质和相应的磷酸化位点的分带模式，建立了一个全面的蛋白质表达和磷酸化的空间多组学图。
转录组分区显示了独特的肝内皮细胞特征
转录组RNA seq共检测到了超过28000个基因，在可进行定量分析的13737个基因中，共有4943个基因在表达模式上有明显的分区特征。整体来说，对肝内皮细胞群体进行空间分类，能够将以前单细胞测序定义的分区的空间分辨率提高了一个数量级，同样的以分区的形式揭示了大约三分之一的可量化的肝内皮细胞转录物。
蛋白丰度的转录后调控
每个基因只有表达了合适的蛋白量才能正常发挥功能，蛋白丰度受到合成和降解的调控。一般认为转录组可以反映蛋白组。基于这样的假设，作者从结果中共找到4169个蛋白-mRNA对。虽然总体上，RNA和蛋白呈现正相关，但不同基因有不同的蛋白表达和RNA表达，一些相似丰度的RNA其蛋白表达量可能有高达1000倍的差异，这反应了蛋白合成和/或降解程度上的差异。这种蛋白和RNA表达的差异性就体现在蛋白/转录本比率上（protein-transcript ratio， PRT）。总体呈现一种向高PRT偏移的高斯分布，而高PRT蛋白数量是低PRT蛋白的3倍（下图C）。核糖体相关的蛋白占了低PRT蛋白中很大一部分，而高PRT蛋白中很多是参与到代谢和生物合成过程等。PTR值的差异表明，不同的核糖核酸翻译效率或蛋白质稳定性可能是肝窦蛋白质分带的主要调节机制。
空间蛋白组学揭示沿着肝脏血管有不同的磷酸化分布
接下来分析了蛋白质表达沿肝窦的空间分布。发现有25%的蛋白是沿着肝小叶轴分区表达的（下图A）。同时，磷酸化基序分析确定了116个保守基序。大约8%的蛋白质具有显著的转录后调节，这导致蛋白质和核糖核酸之间的不同表达模式。约16%检测到的磷酸化蛋白具有显著分区变化，这表明磷酸化状态的空间梯度是沿着肝窦的肝内皮细胞功能特征的主要决定因素。
酪氨酸磷酸化显著富集中央静脉区
为了进一步表征蛋白质磷酸化的空间排列，我们分析了3个主要磷酸化位点的分布。各分区丝氨酸磷酸化和苏氨酸磷酸化的分布大致相等，但酪氨酸（p-Y）磷酸化则相对较严格的富集在中央静脉区（CV）（下图A）。不同磷酸化的空间占比分析更是直观地表明，在CV中有大量的磷酸化酪氨酸（D&E）。作者分析前述的scRNA-seq发现，受体酪氨酸激酶（RTK）是在肝内皮细胞中表达丰度最高的激酶家族，而RTK磷酸化主要发生在中央静脉区。总体，这一部分分析发现，肝小叶中磷酸化活性有明显分区特点，中央静脉区（CV）有显著的受体酪氨酸激酶活性。
中央静脉区酪氨酸激酶Tie1的磷酸化塑造了L-EC分区，同时产生了Wnt9b梯度
作者进一步聚焦具体的受体酪氨酸激酶（RTK），其中血管生成素受体Tie1和Tie2/TEK是高度分区表达的磷酸化蛋白。用Tie1-39对小鼠进行全身治疗 ，2h后检测基因的表达情况，在中央静脉区比门静脉结节的差异更显著。最值得注意的是，心血管标志物基因Wnt9b的表达几乎完全关闭，这表明Tie受体信号是血管Wnt表达的关键调节因子。STAT3促进Wnt9b转录，而FoxO1作为Wnt9b转录阻遏物。
Tie1诱导的Wnt对肝再生是必需的
作者进一步分析了Tie1-Wnt9b信号轴对肝再生的作用。作者构建了在内皮细胞中条件沉默Tie1的小鼠模型，并追踪在切除小鼠2/3肝脏2天后的肝再生情况（下图A&B）。结果发现，Wnt9b和Wnt2这两个在肝内皮细胞中表达的Wnt 配体的表达显著降低，而其他非特异表达的Wnt配体的表达量则未发现显著差异（下图C）。Wnt靶基因——Axin2 和 Tbx3的表达也显著下调（下图D&E）。相似地，两个预示肝脏祖细胞高增殖能力的基因——Sox9 和 Lgr5的表达也显著下调（下图F&G），产生的结果就是，肝再生显著受阻，在肝切除手术2天后，小鼠的肝重/体重值下降(下图H)。总体来看，这些结果表明了Tie1信号依赖的Wnt生成是保持肝再生以及肝损伤后恢复肝质量的关键决定因素。
结 论
1.作者基于单细胞测序（scRNA-seq）的空间分选方法可以进行肝血管系统的多组学解析研究。
2.酪氨酸磷酸化富集在中央静脉区。
3.Tie1- Wnt信号轴对肝再生具有关键促进作用。
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