CRISPR/Cas9技术是近十年最热门的基因编辑工具，基于此发展的CRISPR 文库筛选是一种大规模的功能基因筛选方法，旨在寻找大海中的几根针。CRISPR筛选有助于发现引发细胞类型特定功能或表型差异的关键基因。
CRISPR-KO文库筛选的基本思想是：基于sgRNA引导Cas9至目标位点切割DNA双链，引发非同源修复机制，实现基因的敲除。KO库针对人的两万余个编码基因及千余个miRNA，每个基因设计6个靶点，进行病毒的混合包装，最终产生含有十二万个不同sgRNA序列的混合病毒。随后将病毒感染细胞，在培养皿中敲除每个可能重要的基因，每个细胞中敲除具有不同基因的细胞群。一部分细胞死亡，一部分存活，甚至生长得更好并成为主要的细胞类型，对存活下的细胞群进行基因组NGS测试，以确定哪些序列存在或哪些序列耗尽，最终锁定关键基因。这样的实验可以确定在一定条件下生存所必需的基因，例如肿瘤增殖关键基因1，药靶增敏基因2。
最常见的CRISPR 筛选基于对存活的细胞进行测序，以找出关键因子，这种可以称为阳性筛选。但如果要寻找负性功能的基因，例如对药物敏感基因，由于基因敲除之后，在药物筛选下，细胞死亡，则无法提取其基因组进行靶标分析，那如何确立关键呢？
由于sgRNA序列在设计文库时就确认，既然无法正向从存活细胞中获取靶标，则可以反向确认，即寻找出损耗的sgRNA。ADLI3等人运用CRISPR 筛选，寻找在治疗胰腺导管腺癌中对曲美替尼敏感性基因，作者构建了针对约 4000 个富含表观遗传调节因子、转录因子和核蛋白基因的sgRNA，以0.3xMOI感染了1.5~2亿个细胞，经过曲美替尼的一周筛选，将存活的细胞分成9批，每批约800万个细胞，一部分细胞移植小鼠体内，并以药物筛选；一部分细胞直接在体外培养，随后两种类型被收集用于NGS测序。
sgRNA测序分析可以得出存活细胞的sgRNA，并计算出损耗的sgRNA数量，对前2000 个富集和耗尽的sgRNA进行聚类分析以及GO分析，发现细胞粘附和迁移中起关键作用的基因，如IL8、钙粘蛋白FZR1和转移相关的EGFL6是体内筛选中发现的最枯竭的基因之一，表明这些基因的存在对肿瘤的发生至关重要。曲美替尼治疗的肿瘤中耗尽的sgRNA靶标为有丝分裂细胞周期和动粒功能，例如CENPE、NUF2、MIS12和CENPI以及核糖核苷酸还原酶的催化亚基RRM1。
本文进行的体内、体外的筛选对比，我们先不做论述，由于大部分学者是基于细胞水平的靶标筛选，因此，我们抽提上述实验关于阴性筛选的核心点：
足量的sgRNA覆盖度：常用阳性筛选细胞数为百万至千万级别，本文作者使用了约2亿个细胞，最终获取了单组800万个细胞，考虑到sgRNA数量为4万，因此理论的单个sgRNA覆盖度是200x。足量的sgRNA覆盖对于阴性筛选是必要的，可以减少文库构建及包装过程中靶标丢失造成的实验误差，最终可通过单个基因总sgRNA丢失率得出基因重要性（如A基因设计了10个靶点，假设未丢失一个sgRNA的情况下，理论测得次数为200x10=2000次；而B基因的10个靶点总测得次数为100，则得出B基因95%的sgRNA损耗了，也就是细胞死亡了）；
因此，负性筛选要多一步损耗sgRNA的计算，从损耗的sgRNA推测出关键基因。吉凯基因与张峰实验室达成合作，含有张峰实验室全套的人、小鼠全基因组KO、SAM激活文库，可对全基因组的基因扫描，帮助研究人员找到关键因子，感兴趣的，快来咨询吧！！
【文库病毒使用常见问题】
1. 文库病毒如何确保sgRNA的有效性？
从设计层面，只能保证sgRNA的特异性，单其能否有效引导Cas9蛋白至目标位点切割是未知的，因此常规针对同个基因设计多个靶点，只要一个靶点有效，则能达到基因敲除的目的，如张锋文库针对同个基因设计六个靶点，上述定制文库设计了近十个靶点，因此文库靶点不注重单个靶点是否有效。
2. 如何保证文库的sgRNA完整性？
文库定制完成之后，在病毒包装之前，对抽提的质粒进行NGS测序，保证低于2%的sgRNA丢失率。此2%平均到每个基因上，大约每个基因丢失0.12个sgRNA，远低于每个基因6个sgRNA的数值。从概率上讲，单个基因丢失大于三个sgRNA的概率是极低的，即便文库完整性再下降10%，单个基因也有足量的靶点行使KO。
3. 如何控制进入细胞的病毒数？
文库旨在寻找关键性基因，多为筛选单个功能基因，因此需要尽可能控制单个病毒进入单个细胞，因此文库病毒是以0.3至0.6的MOI感染细胞，不寻求高感染效率。考虑到进入细胞sgRNA的不确定性（如），多些分组，可以排除
4. 如何检测存活细胞的sgRNA？
与已知sgRNA的基因敲除不同，由于存活细胞的sgRNA是未知的，也不清楚哪些基因发生敲除，因此针对目的基因设计检测引物是行不通的。文库的检测是对存活细胞基因组中的sgRNA进行检测，引物本身设计在病毒骨架上，是通用型的。根据测得的sgRNA序列，跟底库列表比对得出靶基因。
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