作者：沈毅辉
在过去的80年里，以蒽环素为基础的化疗被广泛用于治疗恶性和晚期肿瘤。不幸的是，根据以往的研究，蒽环类药物如doxorubicin（DOX，多柔比星，又名阿霉素）可导致心脏毒性并进展为心力衰竭。虽然DOX引起的心脏毒性的多种分子机制已经被报道过，但其中大部分归因于心肌细胞中活性氧（ROS）的过量产生。右丙亚胺作为一种抗ROS疗法已在临床中使用中，临床效果有限，并被证明会增加继发性恶性肿瘤的发生风险，这表明目前对DOX引起心脏毒性的认识尚不全面。近期，复旦大学附属中山医院程蕾蕾/赵健元教授研究团队在Cell death & disease杂志（IF：9.685 ）上在线发表题为“Tripartite motif 25 ameliorates doxorubicin-induced cardiotoxicity by degrading p85α”的文章，通过整合DOX心脏毒性细胞模型蛋白质组和GEO数据库中体内模型转录组数据，寻找参与其发病机制的潜在泛素化E3连接酶，其中，TRIM25是其中变化最明显的泛素化E3连接酶，并且通过验证发现泛素化E3连接酶TRIM25通过泛素化降解p85α减轻DOX诱导的心脏毒性。吉凯基因提供了蛋白质组学服务、质粒和腺病毒等服务和产品。
研究结果
1. 蛋白质组学联合转录组学分析显示TRIM25在DOX处理后发生显著变化
作者分别用DOX或PBS处理小鼠心肌细胞HL-1（3vs.3） 16小时，并采用基于质谱的TMT蛋白质组学（由吉凯基因提供技术服务）检测蛋白谱的变化。在检测到的6326个蛋白中，显著上调蛋白231个，显著下调蛋白167个（fc>1.2或fc<0.83,p<0.05）。差异蛋白的KEGG富集分析显示了与P53信号通路和细胞周期相关通路的富集，表明DOX成功诱导了心脏毒性。研究者同时与GEO数据库中一个体内模型的转录组（GSE40289）数据进行整合分析，通过分析共有上调或下调的和泛素化相关基因，最终共得到6个泛素化相关基因（TRIM25、CBX4、HERC4、NSMCE2、UBE3C和ZFP91）在两个数据集中的变化趋势一致，而其中一个泛素化E3连接酶TRIM25在DOX诱导心脏毒性模型中表达变化最大。
作者在心肌细胞中过表达TRIM25，并使用DOX处理细胞。与PBS处理相比，DOX处理后显著诱导了细胞凋亡。而过表达TRIM25则可显著减弱DOX诱导的心肌细胞的凋亡，这表明，TRIM25有潜在的心脏保护作用。
随后，作者检测了DOX处理不同时间后TRIM25的表达变化。结果表明，TRIM25在DOX处理的早期显著下调，而在DOX处理16h后表达开始升高。因此，作者推测DOX处理早期导致的TRIM25低表达可能诱导了心脏毒性。在小鼠心肌细胞房HL-1和大鼠心肌细胞H9C细胞中都观察到了在DOX处理的早期存在TRIM25表达的下降。而在一个DOX诱导的急性心脏毒性小鼠模型的心脏组织中也检测到了TRIM25的下降。
2. TRIM25通过泛素化p85α增加其降解
TRIM25是个泛素E3链接酶，作者进一步探究了TRIM25的心脏保护作用机制。首先作者过表达TRIM25并通过免疫共沉淀(Co-IP)和质谱检测TRIM25结合的蛋白，其中一个蛋白为p85α，并且在p85α的一个肽段上检测到了泛素修饰位点。反向，过表达p85α后的IP-质谱也检测到了TRIM25。鉴于TRIM25和p85α表达的负相关性，作者认为TRIM25可能通过调控p85α减轻DOX诱导的心脏毒性。
随后，作者检测了TRIM25是否通过泛素化p85α调控其稳定性和表达。shRNA敲低TRIM25会上调p85α的表达；TRIM25过表达则导致p85α下调，而TRIM25敲低还可以延长HEK293T细胞中p85α的半衰期；过表达突变导致的泛素E3连接酶功能缺失的TRIM25则不会影响p85α的表达变化。
GST Pull Down实验也再次确认了TRIM25与p85α的互作。进一步，作者通过表达一系列截短突变的TRIM25来检测TRIM25和p85α互作的结构域。TRIM25 PRY/SPRY结构域与p85α 结合，而p85α 的SH2结构域对于它与TRIM25的互作至关重要。
3. TRIM25过表达可减轻DOX诱导的心脏毒性
作者通过AAV9在小鼠心脏中特异性过表达TRIM25（由吉凯基因提供），与对照组相比，TRIM25过表达组小鼠心脏纤维化、细胞凋亡、内质网应激均得到了改善。
4. TRIM25减轻DOX诱导的心肌细胞内质网应激
前述实验发现DOX处理后会导致内质网（ER）的增大，内质网应激的标志物BIP表达上升，而这种上升在TRIM25过表达的心肌细胞中被逆转。在DOX处理下，控制内质网应激的未折叠蛋白应答（UPR）信号上调。此外，还检测到了JNK磷酸化信号的上调，表明在DOX诱导的调往中存在着UPR的不适应性。相反地，TRIM25过表达减弱了DOX诱导的内质网增大。总体上，体外实验表明，TRIM25可减轻DOX诱导的心肌细胞内质网应激。
5. TRIM25通过泛素化p85α使其降解进而抑制未折叠蛋白反应（UPR）
TRIM25显著减轻了DOX诱导的细胞凋亡，而p85α敲低影响了TRIM25的心脏保护功能。p85α过表达显著消除了TRIM25过表达对减轻内质网应激的益处。进一步的研究表明，p85α过表达后XBP-1s（一个减轻内质网应激的重要转录因子）的核转位减少。IP实验也明确了p85α和XBP-1s间的相互作用。这种作用会被DOX处理减弱，这也降低了XBP-1s的核转位，最终导致了内质网应激的增强。免疫荧光实验表明，DOX处理后p85α上调，这也意味着XBP-1s核转位的下降。
6. p85α 过表达或激活内质网应激均可消除TRIM25的心脏保护作用
考虑到内质网应激和DOX诱导的心脏毒性之间的联系，作者检测了一个抗内质网应激化学分子伴侣——牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）在DOX诱导的心肌病中的作用。结果表明TUDCA可以改善心脏功能和心肌萎缩，减少心肌纤维化的面积。
TRIM25在DOX诱导的心脏毒性中起的保护作用与p85α下调及p85α在非折叠蛋白反应（UPR）中的作用相关。研究者通过尾静脉注射AAV使p85α在小鼠心脏中特异性过表达。在同时过表达TRIM25和p85α的小鼠中，TRIM25的心脏保护作用被削弱。一个内质网应激诱导剂衣霉素（TM）处理后，也得到了类似的结果。过表达p85α或TM处理均可以影响小鼠心脏的收缩性，导致心脏萎缩。此外，作者还检测到了心脏纤维化和凋亡。这些结果明确了TRIM25引起的p85α下调在DOX诱导的心脏毒性中的保护作用。
作者通过蛋白质组学检测DOX处理后心肌细胞中发生变化的与泛素化相关的蛋白，并通过与一个公开的转录组测序数据进行整合，锁定了一个泛素E3连接酶TRIM25。随后，作者通过功能实验和机制实验明确了：
（1）TRIM25可以降低DOX诱导的心肌细胞凋亡，缓解 DOX诱导的心脏毒性；
（2）TRIM25通过抑制心肌细胞的内质网应激和UPR通路激活从而缓解DOX诱导的心脏毒性；
（3）TRIM25通过泛素化p85α促进其降解从而增加了 XBP-1s的核转位来降低内质网应激。
吉凯助力
该研究中使用的蛋白质组学测序、质粒载体以及TRIM25、p85α的过表达腺相关病毒等均由吉凯基因提供。
作者简介
复旦大学附属中山医院程蕾蕾/赵健元教授为论文通讯作者，沈毅辉博士为文章第一作者。
程蕾蕾
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