P8760  兔外周血淋巴细胞分离液试剂盒  200ml/kit产品介绍

        本分离液为Ficoll、羟乙基淀粉550与泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝外周血可在分离液中分层。离心时，在Ficoll、羟乙基淀粉的作用下红细胞与粒细胞聚集并迅速沉降；此时，淋巴细胞及其他单个核细胞仍处于分离液上层，红细胞污染可忽略不计。大部分血小板可在细胞清洗低速离心过程中去除。

        其他人及动物多种比重细胞分离液，因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

        适用于从动物抗凝血液中分离淋巴细胞，无菌条件下所分离的淋巴细胞可用于细胞培养等。本品仅供科研使用。

P8760  兔外周血淋巴细胞分离液试剂盒  200ml/kit

试剂Ａ                       200mL

试剂D                       200mL

样本稀释液（赠品）     200mL

清洗液（赠品）          200mL

保存：18℃-25℃保存，有效期两年。本品易感染细菌，需无菌条件下操作。无菌条件下操作，启封后常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

P8760  兔外周血淋巴细胞分离液试剂盒  200ml/kit操作步骤：

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。首先取抗凝血按体积比1:1的比例加全血及组织稀释液混匀，根据稀释后的样本量大小，分以下两种情况：

情况A: 稀释后血液样本小于5mL时，实验方法如下： 

1. 取一支15ml离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（体积比为3:2，试剂总量与稀释后的血液样本量相等。如稀释后的血液样本为5ml，则先后加入试剂A 3ml、试剂D 2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。

2. 用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-550g，离心20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离 心条件需客户自行摸索，以达到*佳分离效果）。 

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为稀释液层。第二层为透明试剂D液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂A液层。第五层为红细胞层。 

4. 用吸管小心吸取第二层试剂D层和第三层乳白色细胞层到另一15ml离心管中，往所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞。 

5. 250g，离心10min。 

6. 弃上清。 

7. 用吸管以5ml清洗液重悬所得细胞。 

8. 250g，离心10min。 

9. 重复6、7、8，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 

10. 差异贴壁法纯化细胞 

（1） 用单核细胞无血清培养基或单核细胞完全培养基以1.5-3×106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。 

（2） 2-4小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。 

（3） 10-24小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。 

（4） 不贴壁的为淋巴细胞。

注： 

a) 无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加10%自体血浆或2-8%的胎牛血清。 

b) 完全培养基中含2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。 

c) 由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。 

情况B: 血液样本大于等于5mL时，实验方法如下： 

1. 取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂D（试剂A与试剂D体积比为5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。 

2. 将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（*大离心力可至1000g），离心20-30min。（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到*佳分离效果。加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。 

3. 剩余步骤同“情况A”中步骤3至步骤10。 

P8760  兔外周血淋巴细胞分离液试剂盒  200ml/kit 注意事项：

A. 开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。

B. 分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条

件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

C. 血液样本*好为新鲜抗凝血（采血2 h以内），为保持淋巴细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。

D. 稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降低细胞

得率及纯度。

E. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁影响分离效果。

F. 血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索*佳的分离

条件。

G. 吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加；吸取

过多的血浆层可能会导致淋巴细胞中血浆蛋白及血小板污染。

H. 如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。

I. 不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液

的比重、动物种属及被分离细胞的名称。

参考文献

1. BoyumA. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968; 97: 7.

2. Ting A, Morris PJ. A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood. Vox Sang. 1971 Jun;

20(6): 561-3.

3. BoyumA. Separation of Blood Leucocytes, Granulocytes and Lymphocytes TissueAntigens. 1974; 4(4): 269-74.

4. Weisbart RH, Webb WF, Bluestone R, Goldberg LS. A simplified method for lymphocyte separation. Vox

Sang. 1972; 23(5): 478-80.

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